■ 產品簡介

本產品利用高效重組酶和同源重組原理，只需DNA插入片段末端與載體末端具有15-20個同源堿基序列，就可以在載體的任意位點完成目的片段與載體的克隆重組。本產品可實現(xiàn)1-4個片段的高效無縫拼接；采用非連接酶克隆體系，可極大地降低載體的自連，保證產品克隆陽性率在90%以上。

■ 產品特點

1. 靈活的克隆位點：任何載體的任意位置。

2. 快速簡便：30分鐘完成載體構建。

3. 精確：不會增加任何額外的程序。

4. 效率高：高達90%陽性克隆率。

■ 無縫克隆流程圖

■ 常見問答

1、“同源序列”指的是特殊序列嗎？

答：無縫克隆要求的同源序列不是某個特殊序列，簡單講同源序列可以直接理解為“相同序列”，即DNA片段的連接處有15-20個相同的序列。

2、最佳克隆位點選擇？

答：在選擇克隆位點時，應避免選擇上下游50bp內有重復序列的區(qū)域。當克隆位點上下游25bp區(qū)域內GC含量均在40%-60%范圍內時，重組效率將達到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會受到較大影響。

3、同源序列的長度與退火溫度計算？

答：同源序列長度推薦15-20bp。實驗結果顯示，低于15bp（如10bp），轉化率明顯下降；大于20bp（如30-40bp），轉化效率差異不大，考慮成本，不推薦20bp以上。

計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，末端同源序列不應參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。

4、無縫克隆插入片段的最短長度？

答：建議插入片段≥100bp。

5、PCR擴增產物帶A尾（或者其他尾）是否影響無縫克?。?/strong>

答：任何PCR酶擴增產物都可以用于無縫克隆，無需考慮產物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴增突變或者產物要求高保真時，建議使用高保真聚合酶進行擴增。

6、 酶切產物做無縫克隆是否要做去磷酸化處理？

答：不需要。

7、PCR產物做無縫克隆是否要切膠純化？

答：PCR產物同時滿足以下條件時，產物純化即可，不必切膠純化：

A、PCR模板不為質?；蛘哔|粒抗性不同于目標載體；

B、無明顯雜帶且主帶占95%以上。

8、無縫克隆長斑數(shù)較少？

答：主要可能有以下幾種情況：

1）引物設計不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點+基因特異性擴增引物】，GC含量40% - 60%。

2）感受態(tài)細胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細胞，確保其轉化效率>107 cfu/μg。每次操作時可設置一組轉化質粒的對照實驗，以檢測感受態(tài)細胞的轉化效率。選擇克隆感受態(tài)細胞(如DH5α)，不能選擇表達感受態(tài)細胞。

3）線性化載體和插入片段擴增產物的使用量不足/過量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應體系。

4）線性化載體和插入片段擴增產物不純，抑制反應：線性化載體和插入片段擴增產物未純化，直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如10μL體系不超過2μL。建議線性化載體、插入片段擴增產物進行凝膠回收純化，純化產物溶解在ddH2O中。

9、出現(xiàn)較多假陽性？

答：主要有以下幾種可能情況：

1）載體線性化不完全：即使是痕量未完全酶切的載體也會產生很高的轉化背景?？赏ㄟ^陰性對照檢測載體是否線性化完全，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產物等都可以有效減少環(huán)狀質粒殘留。

2）插入片段擴增產物混有非特異擴增產物。建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產物；③鑒定更多克隆。

3）反應體系中混入了相同抗性的質粒：PCR擴增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質粒時，若擴增產物直接用于重組反應，殘留環(huán)狀質粒模板會產生較高的轉化背景。建議擴增產物進行DpnI消化或擴增產物進行膠回收純化。

10、菌落PCR無條帶？

答：主要有以下可能情況：

1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進行菌落PCR檢測。

2）PCR體系或程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質粒條帶。建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質粒，以質粒做模板PCR驗證；或者進行酶切驗證。

3）重組失?。簺]有目的條帶，只有空質粒的條帶。說明重組不成功，載體線性化不完全，建議優(yōu)化酶切體系。