11月22 【成功案例】短期滲透脅迫下西瓜根組織的轉(zhuǎn)錄組研究
Transcriptome Profiling of Watermelon Root?in Response to Short-Term Osmotic Stress
短期滲透脅迫下西瓜根組織的轉(zhuǎn)錄組研究
雜志：?PLOS ONE
影響因子：2.806
PMID:27861528
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研究背景：
干旱是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力、限制物種分布的重要因素。干旱會影響植物某些生理生化過程（如蒸騰作用、光合作用、呼吸作用、碳水化合物和激素代謝）。植物進化出多種應(yīng)對機制（包括逃旱性，避旱性和抗旱性），這種機制涉及精細(xì)復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)及多分子通路間的相互作用。
西瓜富含必需營養(yǎng)成分（如糖、番茄紅素、對心血管有益的氨基酸類），是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的瓜類作物。干旱會減少西瓜產(chǎn)量，栽培西瓜較野生西瓜抗旱性更強，但相關(guān)研究較少。M08是一種栽培西瓜近交品種，抗旱性強。為了解栽培西瓜根系對滲透脅迫響應(yīng)分子機制及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，本研究進行了滲透脅迫下西瓜根系的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。
材料和方法
PEG6000處理的M08植株幼苗根系，依據(jù)處理0、3、6、12、24h時表型和Cla007307 (WRKY) and Cla006761 (MYB)基因轉(zhuǎn)錄水平來確定mRNA測序時間點。實驗組（T-1，T-2，T-3），與對照組(CK-1，CK-2，CK-3)一起進行mRNA測序。
測序平臺：百邁客Illumina HiSeqTM 2500平臺
分析平臺：百邁客云平臺（BMKCloud）具體分析如下：
矯正后clean reads比對到西瓜參考基因組（TopHat ），基于DESeq進行差異表達(dá)基因（DEGs）分析（FC≥2，F(xiàn)DR＜0.01），隨后進一步進行GO分析、GO富集、KEGG通路分析。
研究結(jié)果：
- 轉(zhuǎn)錄組測序時間點選擇
西瓜幼苗在滲透脅迫下，6h時出現(xiàn)枯萎，12h和24h時出現(xiàn)嚴(yán)重枯萎（圖1A）。 Cla006761上調(diào)并在6h時達(dá)到最高，Cla017928下調(diào)在6h達(dá)到最低值（圖1B）。結(jié)合幼苗表型及Cla017928和Cla006761的動態(tài)表達(dá)結(jié)果，選擇處理6h的樣本進行RNA測序。
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圖1A M08幼苗在滲透脅迫處理不同時間的表型特征
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圖1B 滲透脅迫下P5CS、MYB基因表達(dá)的動態(tài)變化
- 測序結(jié)果
6個文庫共得到32.99 Gb的clean reads，每個文庫＞40M（表1）。unique mapped reads的比例為8.513％到86.10％，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高。
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表1.測序數(shù)據(jù)?
qRT-PCR驗證18個不同表達(dá)水平的基因，驗證結(jié)果與測序結(jié)果一致。生物學(xué)重復(fù)間相關(guān)性評估結(jié)果顯示相同處理組高度相關(guān)，CK和實驗組相關(guān)性弱。以上結(jié)果均表明測序數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。
- DEGs鑒定
基于DESeq進行DEGs分析，共鑒定出滲透脅迫下5246個差異表達(dá)基因，其中2753個上調(diào)，2493個下調(diào)。DEG包含大量不同的基因，說明西瓜根系對干旱響應(yīng)涉及復(fù)雜的調(diào)控機制。 - GO分類和KEGG分析
將DEGs在與COG（2174），GO（4528），KEGG（1203），Swiss-Prot（3954）、NR（5173） 比對后，共注釋了5175個DEG?。用BLAST2GO檢索GO數(shù)據(jù)庫中的DEG并用WEGO進行GO功能分類。將4528個DEG歸為以下三類：生物學(xué)過程（4148），分子功能（3670）和細(xì)胞成分（4177）（圖2）。
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圖2.GO分類
富集的GO terms包含缺水響應(yīng)、高滲鹽度響應(yīng)、乙烯響應(yīng)。此外幾個高度富集的terms（植物型超敏響應(yīng)調(diào)節(jié)、損傷響應(yīng)、真菌防御響應(yīng)、防御響應(yīng)突發(fā)性呼吸）在西瓜根部不同脅迫響應(yīng)中相互作用，與其他植物中的結(jié)果一致。
一些與根生長相關(guān)的生物學(xué)過程是顯著抑制的，如細(xì)胞增殖、分生組織生長調(diào)節(jié)、有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)換、細(xì)胞板形成的胞質(zhì)分裂、核糖體生物起源、核糖體、微管、翻譯、DNA復(fù)制調(diào)控、DNA復(fù)制起始等。說明PEG誘導(dǎo)的滲透脅迫可能會抑制西瓜根系生長。
植物激素在不同脅迫響應(yīng)中起重要作用，本研究中大部分涉及激素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑、乙烯響應(yīng)、水楊酸生物合成過程的基因表達(dá)上調(diào)。
蛋白折疊影響蛋白質(zhì)功能，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蛋白折疊的多種信號可激活未折疊的蛋白質(zhì)發(fā)生響應(yīng)，甚至致使細(xì)胞程序性死亡（PCD）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白質(zhì)響應(yīng)是本研究中高度富集的term，表明滲透脅迫會影響蛋白折疊。在滲透脅迫時，根尖分生組織自噬PCD激活，根尖優(yōu)勢喪失，根系結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)來適應(yīng)滲透脅迫。富集到的GO terms包含細(xì)胞程序性死亡調(diào)節(jié)、根形態(tài)發(fā)生，表明滲透脅迫下PCD程序可能在根尖分生組織中激活，同時發(fā)生根系結(jié)構(gòu)重構(gòu)。
KEGG分析結(jié)果顯示共825個分配到108個不同的生化途徑。DEG最多的前5個途徑分別是核糖體、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物病原體相互作用、嘌呤代謝、淀粉蔗糖代謝途徑（圖3）。其中核糖體途徑變化顯著。大部分核糖體通路中的基因都是下調(diào)的，與GO分析結(jié)果一致。
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圖3.KEGG分析
- 滲透脅迫響應(yīng)的保護基因
參與滲透調(diào)節(jié)的基因
在滲透脅迫條件下，相容性溶質(zhì)分子（如脯氨酸，甜菜堿和海藻糖）會增加，來維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膨壓和水平衡。P5CS是高等植物脯氨酸合成的限速酶，鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（OAT）是脯氨酸合成鳥氨酸途徑中的脯氨酸合成酶。在滲透脅迫下，根中P5CS（Cla017928）和OAT（Cla019569）表達(dá)下調(diào)。而編碼脯氨酸脫氫酶的Cla016474（ProDH）上調(diào)。在滲透脅迫下TPS基因（Cla019181，Cla010101和Cla009709）和TPP基因（Cla005675，Cl008123，Cla006270和Cla014481）表達(dá)上調(diào)，參與蔗糖和肌醇半乳糖苷代謝的基因顯著上調(diào)，另外四個淀粉酶基因也是上調(diào)的。
活性氧（ROS）清除
ROS是有氧代謝過程中重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及毒副產(chǎn)物。非生物脅迫（如干旱、高鹽、洪水、寒冷和炎熱）會擾亂細(xì)胞代謝平衡，致使植物ROS生成過量，從而損傷蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，碳水化合物和DNA。突發(fā)性呼吸氧化酶同系物（Rboh）蛋白與ROS產(chǎn)生有關(guān)。植物進化出一些高效酶（如超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶），以及非酶抗氧化劑（ASH、GSH）來清除過量的過氧化物自由基。在本研究中，編碼Rboh的四個基因顯著上調(diào)。抗壞血酸過氧化物酶，谷胱甘肽還原酶、單脫氫抗壞血酸還原酶，脫氫抗壞血酸還原酶，谷胱甘肽過氧化物酶以及大部分谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶基因表達(dá)上調(diào)，但超氧化物歧化酶基因Cla011317表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明滲透脅迫可能誘導(dǎo)復(fù)雜的抗氧化網(wǎng)絡(luò)。此外也富集到與維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)相關(guān)的硫氧還蛋白和谷氧還蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄本。
其他滲透保護相關(guān)DEGs
MATE是一組新發(fā)現(xiàn)在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)運蛋白。本實驗共得到18個MATE轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)的DEG。水通道蛋白是一種膜蛋白，能促進水分跨膜轉(zhuǎn)運并維持細(xì)胞水平衡。本研究中，共8個編碼水通道蛋白的基因顯示出差異表達(dá)。LEA蛋白是重要的細(xì)胞脫水保護蛋白，其表達(dá)量與耐脫水性相關(guān)，在滲透脅迫下有兩個LEA（Cla015386和Cla009416）上調(diào)。此外編碼分子伴侶（如熱休克蛋白（HSP），分子伴侶，DnaJ樣蛋白）的DEGs也是差異表達(dá)的。
- 蛋白激酶，磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的DEGs
滲透脅迫誘導(dǎo)植物中的鈣信號，本研究涉及Ca2 +結(jié)合蛋白的DEGs在滲透脅迫下表達(dá)上調(diào)。Map激酶級聯(lián)成員在滲透脅迫中起重要作用，本研究檢測到13個編碼MAP激酶的DEGs，幾個與SnF1相關(guān)蛋白激酶，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和磷酸酶有關(guān)的DEGs表達(dá)上調(diào)。在磷脂信號系統(tǒng)中，磷脂酶催化IP3和DAG等信使形成以調(diào)節(jié)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。在本研究中檢測到與磷脂酶相關(guān)的DEGs（包括PLA、PLC、PLD）。許多功能基因的表達(dá)主要受特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。我們結(jié)果中也列出了轉(zhuǎn)錄因子家族的DEGs。
? ? 7.植物激素相關(guān)DEG
植物激素介導(dǎo)植物對生物/非生物脅迫的響應(yīng)，對于植物適應(yīng)環(huán)境變化具有重要意義。本研究結(jié)果中列出了與脫落酸（ABA），生長素，細(xì)胞分裂素，赤霉酸（GA），乙烯和茉莉酸（JA）等植物激素信號相關(guān)的DEGs。
編碼ABA生物合成關(guān)鍵酶NECD的Cla009779和Cla005404基因表達(dá)上調(diào)，與乙烯合成相關(guān)基因（如ERF轉(zhuǎn)錄因子、ACS、ACO等）的表達(dá)上調(diào)。吲哚-3-乙酸（IAA）是植物中的主要生長素，由色氨酸（Trp）依賴/非依賴性途徑合成。YUC家族和TAA家族的色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是Trp依賴途徑中的IAA生物合成中的關(guān)鍵酶。我們結(jié)果中，兩個YUC和一個TAA表達(dá)下調(diào)，生長素轉(zhuǎn)運蛋白基因如LAX和PIN表達(dá)也下調(diào)。GA是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要植物激素，本研究中編碼GA生物合成關(guān)鍵酶的基因（Cla021351）表達(dá)下調(diào)，而編碼GA2-氧化酶（GA2ox）的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)，這可能使GA的內(nèi)源性水平和生物活性下降。此外，茉莉酸和細(xì)胞分裂素的生物合成途徑的轉(zhuǎn)錄本也受到滲透脅迫的影響。
? ? ?8.其他DEGs
許多與細(xì)胞分裂和根生長相關(guān)的DEGs表達(dá)下調(diào)，如CYC、CDK、MAP、Ran、E2F、DOF、核糖體、肌動蛋白和微管蛋白等。
泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）可去除非生物脅迫導(dǎo)致的錯誤折疊或損傷蛋白質(zhì)。E3連接酶除在UPS中發(fā)揮重要作用外，還可調(diào)節(jié)ABA依賴的應(yīng)激信號。本研究得到了許多E2結(jié)合酶、E3-蛋白連接酶相關(guān)的DEG，說明滲透脅迫可誘導(dǎo)UPS去除機制和E3調(diào)節(jié)機制的發(fā)生。
結(jié)論：
滲透脅迫影響西瓜的生長、品質(zhì)和產(chǎn)量。增強西瓜對高鹽，缺水等因素引起的滲透脅迫耐性是提高生存率的有效途徑。根系是重要的吸水組織，參與滲透脅迫的初始反應(yīng)。為了更好地闡述西瓜根系組織應(yīng)對短期滲透脅迫的分子機制，將西瓜自交系M08用20％的PEG6000處理6h，未處理根組織作對照，進行了全基因組差異基因表達(dá)分析。RNA-seq得到32.99Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)集闡述了基因表達(dá)譜，鑒定出5246個差異表達(dá)的基因，GO富集和KEGG分析表明，短期滲透脅迫影響滲透調(diào)節(jié)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激素應(yīng)答，細(xì)胞分裂，細(xì)胞周期和核糖體等過程，M08根組織對短期滲透脅迫響應(yīng)適應(yīng)過程與滲透調(diào)節(jié)，ROS清除、滲透脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和根系生長抑制等通路有關(guān)（圖4）。
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圖4.滲透脅迫下西瓜根系DEGs總覽
創(chuàng)新點：
這是第一個栽培西瓜品種根系滲透脅迫響應(yīng)的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，為深入探討西瓜根系滲透脅迫響應(yīng)分子機制提供了新的思路。
參考文獻(xiàn)：
Yang Y, Mo Y, Yang X,?et al. Transcriptome Profiling of Watermelon Root in Response to Short-Term Osmotic Stress.[J]. Plos One, 2016, 11(11):e0166314.